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58 材料T程/2011年6期 等离子体处理乙丙交酯共 表面固定胶原的研究 聚物 InvestigationofPlasmaTreatmentandCollagenImmobilization — ontheSurfaceofPoly(1actidglycolideacid)崔 媛,段 潜,李艳辉 (长春理工大学,长春130022) — CUIYuan。DUANQian.LIYanhui (ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China) 摘要:选择等离子体对乙丙交酯共聚物(PLGA)表面进行活化处理来接枝胶原。通过测定等离子体处理后PLGA材料 表面水接触角确定最佳处理功率为60W,时间5rain。XPS分析确定胶原表面的羧基与PLGA表面等离子体激活的羟基 发生了反应生成酯基,而使胶原接枝到PLGA表面。选用小鼠胚胎内皮成纤维细胞(3T3)在PLGA材料表面培养。实 验定性观察确定胶原接枝有利于细胞的黏附和增殖。采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)对不同时期两种细胞生长情 况进行定量分析,结果表明,接枝胶原的存在改善了细胞黏附作用,加快了细胞的增殖速度。 关键词:PLGA;等离子体;胶原 中图分类号:TQ225.24 文献标识码:A — 文章编号:1001-4381(2011)06005805 — Abstract:Forcollagenisamajorcomponentoftheextracellularmatrix。whenthesurfaceofpoly(1ac— tidglycolideacid)(PIGA)isgraftedwithcollagen,cytocompatibilityofPIGAwillbeimproved. PlasmatreatmentiSselectedtoimmobilizecollagenonthesurfaceofPIGA.0ptimumpowerand treatingtimeofplasmaaredeterminedbycontactangletest.Theresultsindicatetheyare60Wand — 5min,respectively.XPSanalysisrevealsthatcarboxygroupsoncollagenarereactedwithactivedhy droxylgroupsonthesurfaceofplasmatreatedPIGAtoformestergroups.Thencollagenisimmobi lizedonPIGA.CytocompatibilityevaluationofcollagenimmobilizedPLGA(COIPIGA)wascarried outbyseeding3T3cellsonthesurfaceofCO1PLGA.Quanlitativeandquantitativeanalysisproved — thatcelladhesionandproliferationareimprovedaftercollagengrafting.Quantitativeresultisob tainedbyMTTassayincelllivingperiod. Keywords:PIGA;plasma;collagen 乙丙交酯共聚物(PLGA)是羟基乙酸和乳酸聚合 而成的无功能侧基的共聚物,它兼有聚乙交酯和聚丙 交酯二种聚酯材料的优势。该共聚物结构规整,组成 固定,降解性能稳定。PIGA可以通过调节组成、分子 量来调节其生物相容性、生物降解速度、增强材料的强 度和模量,因此,PIGA已被广泛地应用于生物医学工 程领域,如药物缓释体系,生物体吸收性缝合材料,内 置隔离材料,骨科固定及组织修复口]。但是作为组 织工程材料,PLGA同时也存在的许多的缺点,PLGA 中有大量的酯键,亲水性差,降低了它与其他物质的生 物相容性这会导致体内的排异反应,形成发炎、感染、 本体组织坏死和血栓等,因此,实际应用中要对材料进 行改性处理l4。等离子体表面改性由于不影响材料本 体特征,并能在材料表面引入大量可供反应的化学基 团,因此,这种方法目前在生物材料表面改性方面得到 了越来越广泛的应用j。而在材料表面固定胶原, 也是目前提高生物材料表面相容性的一个有效手 段l8。本研究采用等离子体处理PLGA膜材料表 面,在其上面形成了具有可供反应的官能团后,在上面 固定胶原,并通过一系列的表征分析手段确定胶原的 接枝和细胞相容性的提高。 1实验 1.1原材料 PLGA,分子量8万,乙醚沉降提纯,备用;胶原: — 实验室自制。;MTT(CH18BrNS):美国AMER SCO公司;培养基(DMEM):GIBCO(USA);标准胎 等离子体处理乙丙交酯共聚物表面固定胶原的研究 59 牛血清,3T3(小鼠胚胎内皮成纤维细胞):中国医学科 学院生物医学工程研究所;氯仿、醋酸(HAc)、DMSO (二甲基亚砜):分析纯,北京鼎国生物技术有限责任公 司;其他试剂均为分析纯。 1.2等离子体表面处理 将纯化过的PLGA溶解在氯仿中,配成0.1 (W/V)的溶液,将玻片放入底面平整的平皿中,调成 水平。将定量的PLGA溶液分别加入平皿中,缓慢蒸 发溶剂,在硅化好的玻片表面干燥成膜。将表面铺有 PLGA膜的玻片放在CTP一2000k高性能等离子体辉 光放电发生器腔内,按不同的等离子处理功率对材料 进行辉光放电表面处理。通过测定材料表面的水接触 角,确定最佳的处理条件。 1.3胶原在PLGA表面接枝固定及表征 表面激活的PLGA膜用磷酸盐缓冲溶液(PBS)透 ℃ ℃ 析过的胶溶液直接涂覆表面,4放置6h后在37放 置1h,去掉表面凝胶薄层。然后用0.3(V/V)的丙 二酸浸泡30min除去未接枝的胶原,然后漂洗薄膜 4~5次,PBS漂洗4~5次,三蒸水漂洗5~6次,晾 干,并在室温测定样品表面水接触角(接触角一 DSA100,KRUSS公司)。 从前面的实验结果中,选择最好的处理条件,接枝 胶原,进行X射线光电子能谱(XPS)测试分析,未处 理的PLGA膜做对照,来确定胶原是否成功地在PI一 GA表面接枝固定。其中XPS(VGESCALABMK 1I)采用固定通过能模式,激发源为Mg标准源K线, Mg靶电压8.0kV,靶功率240W,X射线入射角为 45。,分析室气压保持2.6× 10Pa。 1.4接枝胶原后材料细胞相容性评价 选择3T3(小鼠胚胎内皮成纤维细胞)对接枝胶原 前后的PLGA进行细胞相容性评价。将细胞种在材 料表面,细胞接种密度为1× 1O个/mL。观察细胞在 材料表面上培养24h时的状态,确定胶原固定是否可 以促进细胞黏附和增强材料的细胞相容性。 通过MTT分析确定细胞在材料表面的生长情 况,通过酶联免疫检测仪(MultiskanMK3,Thermo ElectronCorporation)测定吸光值,反映出细胞的增殖 或衰减。 2结果与讨论 2.1PLGA等离子体处理接枝胶原前后接触角变化 用等离子体在室温下激活PLGA表面,处理功率 为4O,50,6O,80W和160W,处理时间2,5,10min和 20rain。将测得的水接触角平均值列于表1中。 表1等离子体处理的PLGA表面水接触角(。)平均值 Table1Averagevalueofwatercontactangle(。)of eachdifferentplasmatreatedPLGA 从表1可以看出,在一定的等离子体处理时间条 — 件下,PLGA经过表面等离子体处理后(LPPLGA), 水接触角有了明显的下降,但是在低处理功率下(40, 50W),PLGA表面水接触角下降不多;随着处理功率 的增加(90W),PLGA表面水接触角出现突降;在处理 功率达到80W后,PLGA表面水接触角达到最低,并 且基本保持稳定。在大功率(>80W)处理条件下, PLGA表面水接触角随处理时间的变化不大;处理功 率为60W时,处理时间的增加反倒不利于材料亲水性 的提高。亲水性很强的表面不利于蛋白质的吸附,从 而不利于细胞的黏附。 等离子体功率不同的时候,对材料表面造成的轰 击效果会出现差异,材料表面的粗糙程度,引入的活性 基团都会受到影响,因此会出现亲水性的差异。实验 数据显示,60W的处理功率得到的几个水接触角数据 范围都在材料亲疏水平衡范围内,因此,本实验选择 60W的处理功率对PLGA进行表面等离子体处理接 枝胶原,理想的处理时间为5min。如果处理时间过 长,材料表面被过渡刻蚀,不但影响材料的本体性能, 还有可能使得材料表面的亲水活性基团湮灭,亲水性 下降。 通过上面的实验选择出处理参数(60W,5min)对 PLGA表面进行等离子体处理,然后接枝胶原。测定 — 表面接枝胶原的PLGA(COLPLGA)的水接触角,取 1O个测量点,取平均值为36.45。。可见胶原的接枝也 可以提高PLGA的亲水性,而且能够保持材料表面最 佳的黏附细胞的亲水范围(最佳的接触角为20。~ 40。)。 2.2PLGA表面接枝胶原前后表面XPS分析 用XPS对几种PIGA在等离子体接枝前后样品 的表面进行表征,通过表面元素分析和C谱的差别确 定等离子体对PLGA改性的效果,同时确定胶原是否 在PLGA表面接枝。 对PLGA,LP_PLGA和COL-PLGA膜表面进行XPS 60 材料工程/2011年6期 测试分析,得到的元素相对摩尔分数结果列于表2。 表2样品表面元素相对摩尔分数 Table2Relativemolefractionofelementsofdifferentsamples 从表2可以看出,未经处理的PIGA表面氧元素 含量比较高,不含氮元素;经过空气等离子体处理后, 材料表面出现少部分氮元素,同时氧元素的含量大幅 度增加;而对COI一PLGA来说,表面氧元素含量下 降,氮元素含量增加。说明等离子体处理可以改变 PLGA表面的元素组成,同时从氮含量增加可以判断 胶原在材料表面有效接枝。结合C谱分析PLGA表 面改性过程中可能发生的反应。图1给出了几种样品 XPSCh分峰图。 图1XPSC1。分峰图 — (a)PIGA膜Cl分峰;(b)LPPLGA膜C1。分峰;(c)COLPLGA膜C1。分峰 Fig.1XPSC1dividepeakchart ’ — ’ ’ (a)PLGAfilmSCl;(b)LPPLGAfilmSC1;(c)COL,PLGAfilmSC1 PLGA膜的C谱图可以分成3个主峰,如图1 — — (a)所示,分别是结合能在284.6eV的CH和Cc — — — 峰,286.2eV的CO(COH)峰和288.6eV的O— — CO(cOOH)。PLGA等离子体处理后,LPPU表 面Cls谱分成的三个主峰与PLGA类似,如图1(b)所 — 示。胶原接枝后,COLPLGA膜的C1S谱可以分成4 个主峰,如图1(c)所示,分别是结合能在284.4eV的— — — —— CH和CC峰,285.3eV的CN和OCOC — — 峰,结合能在286.5eV的CO峰和288.4eV的O— CO。根据上面分峰的结果,计算出每个样品表面基 团相对摩尔分数,结果列于表3中。 表3XPSC。。分峰分析结果 Table3Fractionofcarbonfunctionalgroupsfrom high-resolutionC1。XPSpeaks一 . Molefractionoffunctionalgroups/ Sample 对图1和表3对照分析,可以看出,PLGA材料表 —— 面的OCO含量较高,没有含N官能团,见图1 (a);经过等离子体改性的PLGA材料表面含氧的官 — 能团含量上升,其中COH含量上升近1O9/6,COOH 含量上升2左右,但是没有出现带有端基N的官能 — 团,见图1(b);而前面的元素分析结果在LPPIGA 表面出现的N元素,可能由于含量有限而在C分峰 — 时空气等离子体处理PLGA表面生产的NC一0 — — (结合能在287.2eV附近)被屏蔽在OCO峰中。 胶原接枝后,C谱出现了新的子峰,结合能在 — —— 285.3eV的CN和OcOC峰,相对摩尔分数高 — 达30.O4,同时,CO键的摩尔分数下降到 17.37。说明PLGA表面经过等离子体改性后材料 — — 表面性能发生了改变。CO键的含量下降和CN — 与OCOC的出现说明胶原表面的羧基与PLGA 表面等离子体激活的羟基发生了反应生成酯基,胶原 通过共价接枝到PLGA表面。 2.3胶原接枝前后3T3细胞在PLGA表面不同阶段 生长状态 — — 将3T3细胞接种在PLGA,LPPLGA和COL PLGA表面,培养24h后开始观察细胞黏附和生长状 态,细胞在玻片上的状态作为对照,如图2所示。 从图2(a)可以看出,PLGA表面贴壁生长的细胞 刚刚进入了增殖期,细胞增殖速度比较慢,但是已经可 — 以看到细胞的分化;LPPLGA和玻片表面贴壁的细 — 胞已经出现大量增殖的现象;而COLPIGA表面贴 62 材料工程/2011年6期 3结论 (1)通过等离子体表面处理,在PLGA表面引入 可供反应的羟基和羧基等活性基团。可直接在其表面 固定胶原。 (2)等离子体处理最佳条件(处理功率60W,处理 时间5min)用接触角测试获得,并用XPS分析胶原固 定前后PLGA表面的变化,分析表明,这种方法可以 使胶原在其表面固定。 (3)通过在材料表面培养细胞确定材料的细胞相 — 容性。结果表明,经等离子处理并固定了胶原的PL GA,细胞在其上的生长和增殖都得到了大幅度的提 高,这种方法可以提高材料的细胞相容性。 [1] [2] [3] [4] 参考文献 SHIHC,WAIDRONN,ZENTENRGM.Quantitativeanalysis — ——— ofesterlinkagesinpoly(dllactide)andpoly(dllactideCOglycol ide)[J].JournalofControlledRelease,1996,38(1):6973. 张宗勇,闫玉华.聚乳酸在生物医学领域中的应用[J].生物骨科 — 材料与临床研究,2005,2(5):4447. 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